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双向奔赴,需要走对路--从氧化酶看干化学与革兰氏染色

双向奔赴,需要走对路--从氧化酶看干化学与革兰氏染色

  • 分类:新闻资讯
  • 作者:世硕新语
  • 来源:世硕新语
  • 发布时间:2022-08-24
  • 访问量:0

【概要描述】

双向奔赴,需要走对路--从氧化酶看干化学与革兰氏染色

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硕世阴道炎多项联检卡多了一个新指标--氧化酶。这是一个简单而又不简单的名字,说它普通,确实言简意赅,三个字就定调了大体功能。不普通,是这个名字起的又太过于泛泛,相比前面的乙酰氨基葡萄糖苷酶、唾液酸苷酶等让人一看就知道具体是干嘛的。而氧化酶···具体是氧化什么?所以本期的内容,我们主要讨论3个问题:这个氧化酶是什么?氧化酶是干嘛的?氧化酶检测淋球菌是什么原理?


氧化酶是什么?


目前国际生物化学与分子生物学联合会确定了酶的分类原则,将所有酶按照催化的反应类型统一分成七大类,即:氧化-还原酶(EC1)、移换酶(EC2)、水解酶(EC3)、裂合酶(EC4)、异构酶(EC5) 、连接酶(EC6)以及2018年新加入的转位酶(EC7)。在每一个大类中,还有具体的小类,就比如我们前面介绍的乙酰氨基葡萄糖苷酶,按照分类属于水解酶下面糖基化酶下面的糖苷酶的下面,编号为EC3.2.1.52(详见:微生态战争中的血与火——那无处安放的乙酰氨基葡萄糖苷酶)。那么问题来了,氧化酶这个名字,我们初步知道它在第一大类的氧化酶下面,剩下的···就另想办法了。


图:BRENDA EnzymeDatabase 酶的EC编号分类


所以我们从微生物的角度再来看一下会发现,这家伙在微生物鉴定领域还真是一位重要角色,根据细菌的代谢情况,大体上可以分为氧化酶阴性细菌和氧化酶阳性细菌。类似的还有触酶即过氧化氢酶(详见:你有“核武”,我有“过氧化氢”——详解阴道乳杆菌的终极杀招)、凝固酶等等。而氧化酶全称为细胞色素氧化酶或细胞色素C氧化酶( cytochromecoxidase,CcO),就像西游记中银角大王抱着葫芦说的那句话“我叫你名字你敢答应吗?”所以按照酶的命名习惯,知道了全名也就知道了它大概是干嘛的,也就没啥神秘感了。

 

接下来问题就来到了这个细胞色素C,如果对它不熟悉没关系,因为大家一定熟悉它的一个近亲--血红蛋白。众所周知,血红蛋白是动物体内氧气的运输工,通过自身的氧化还原反应调整自身的构象可以与分子氧可逆的结合,达到搬运分子氧的功能。作为血红蛋白的同族,细胞色素C功能也相似,只不过有点小小的区别。

 

与血红蛋白的结构类似,那么细胞色素C也能被氧化和还原。通常由于其在进化上比较保守,因此分布较血红蛋白更为广泛,除了人等有血液的脊索动物,几乎动物、微生物等涉及到有氧呼吸的理论上都会有细胞色素C。这里我们就不得不提到一个重要的概念--呼吸链。对于学过生物化学的朋友应该不会陌生,其实就是电子传递链,主要是为糖类最终有氧代谢时将氢和电子传递给分子氧生成水(如下图)。从呼吸链的示意图可以看到,细胞色素C是呼吸链的最后一环,也就是电子通过辅酶Q系统传递给细胞色素C,再由它传递给分子氧。与血红蛋白类似,得到电子的细胞色素C呈还原态,然后又把电子送给分子氧再回到氧化态。那么催化细胞色素C从辅酶Q那得到电子的被称为细胞色素C还原酶,而催化还原态的细胞色素C将电子传递给分子氧的就是细胞色素C氧化酶,即我们今天要说的氧化酶(CcO)。

 

图:呼吸链示意图


细胞色素与氧化酶


细胞色素是一类以铁卟啉(或血红素)作为辅基的电子传递蛋白,广泛参与动、植物,酵母以及好氧菌、厌氧光合菌等的氧化还原反应。前面我们也已经知道,细胞色素的主要功能就是通过其血红素辅基中铁原子的还原态(Fe2+)和氧化态(Fe3+)之间的可逆变化作为电子载体传递电子。细胞色素可按其吸收的光的波长分为3类,已鉴定出至少30种不同的细胞色素,分别为细胞色素a、b、c。

 

细胞色素C的结构图:A.细胞色素c的化学结构; B.单细胞色素C三维结构; C.多细胞色素c聚合体


前面我们知道CcO才是真正呼吸链的最后一环,而本质上细胞色素C氧化酶与还原酶一样,也都是细胞色素,就像氧化酶实际上是细胞色素a和细胞色素a3结合成的大分子寡聚体,而两种细胞色素通常不单独发挥作用,因此氧化酶又被叫做细胞色素aa3,还原酶则复杂一些,包含4个细胞色素b(b562、b566各两个)、2个细胞色素c1和一个铁硫蛋白,所以在细胞色素C这里的电子传递应该是这样的:b→c1→c→aa₃→O₂。

 

而且大家所知道的如一氧化碳中毒、氰化物中毒等都是因为两者阻断了c–Cyts结合使其不能再将电子传递给氧化酶导致呼吸链中断,最终造成机体的缺氧死亡,而应对这些中毒时常会为中毒者补充大量的c–Cyts也是为了试图填补呼吸链的中断。我们说回到CcO,从呼吸链的示意图我们可以看到,所谓的氧化就是将得到了氢原子的电子呈还原态的c–Cyts再脱掉电子变回为氧化态,进而完成氢原子的电子传递和水的生成。所以,作为呼吸链的最末端的酶,它们常出现在真核细胞的线粒体膜上,而原核细胞则由于没有这高端设备,所以基本上都在细胞膜表面上,因此对氧的利用较真核细胞低的多。

 


图:细胞色素氧化酶的三维结构分子结构
 


细菌中的氧化酶


在前面我们知道氧化酶是细菌鉴定中的一个重要的酶,其主要用来进行非发酵细菌的鉴定。那非发酵细菌又是什么?要说明这个问题,我们还是要来建立一个框架,即简单的来说细菌代谢葡萄糖的途径大体上可以分为三类,氧化(呼吸)、发酵和不代谢。在分解葡萄糖的过程中,必须有分子氧参加的,称为氧化型,氧化型细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖;细菌在分解葡萄糖的过程中,可以进行无氧降解的,称为发酵型,发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖;不分解葡萄糖的细菌称为产碱型;这就是细菌鉴定中常用的鉴定方法之一即氧化-发酵实验(O/F实验)。所以理论上,基本上氧化酶主要存在于氧化型细菌即非发酵细菌之中。

 

图:革兰氏阴性杆菌O/F实验结果(左、中),葡萄球菌与微球菌O/F实验结果(右))


那么非发酵细菌一定都是氧化酶阳性吗?在微生物界,有句名言,万事无绝对(或许放之大多数领域都行得通)。比如非发酵细菌中的不动杆菌属就是氧化酶阴性,而以发酵代谢为主巴斯德菌属反而氧化酶阳性。所以,这与干化学检测与形态学检测的状况相似,即很难通过单一的酶反应确定某一种甚至某一类细菌,因此仍需要系统的生化检测方法或者辅助形态学进行鉴定,就像从微生物鉴定的大原则上,通常氧化酶主要用于革兰氏情况相同且菌体形态相同的细菌间的区分,比如在革兰氏阴性杆菌中用来区分肠杆菌(阴性)和非发酵杆菌(主要是假单胞菌);在革兰氏阴性球菌中用来区分奈瑟菌属、莫拉菌属(阳性)及不动杆菌属(阴性);在革兰氏阳性球菌中用来区分葡萄球菌(阴性)与微球菌(阳性)等。

 

图:鲍曼不动杆菌痰涂片(左)、淋病奈瑟氏菌尿道分泌物涂片(中)与莫拉氏菌的痰涂片(右)

氧化酶应用于阴道分泌物检测


目前氧化酶阳性的细菌还是比较多的,除了我们前面提到的,还有像耶尔森菌属、放线杆菌属、根瘤菌属等以及部分的布鲁菌属、弗朗西斯菌属、弧菌属等。而对于阴道分泌物样本的氧化酶检测,目前主要有两种解释:一是作为需氧性阴道炎的辅助检测,二是作为淋病奈瑟氏菌的检测。从原理上来看,后者似乎比前者靠谱的多,因为奈瑟氏菌属中的各种都是氧化酶阳性的。而需氧性阴道炎的主要病原体,葡萄球菌、埃希氏菌、链球菌等基本上都是氧化酶阴性。不过话说回来,从原理上来讲,淋球菌也算是需氧菌,但是其更多的是引发宫颈炎而很少引起阴道炎。因此用氧化酶去检测需氧性阴道炎,可以说压根就没啥谱。那么再回到实际上,微生物的鉴定试验都是以细菌的纯培养物进行检测,而放到实际样本中,阴道菌群又是相对复杂的,各种微生物间相互作用,再加上样本的其它影响,也会造成各菌体间代谢产物表达的不一致。比如在加入了血红素和氧气后,部分原本氧化酶阴性的乳球菌也会变为氧化酶阳性。因此,氧化酶在阴道分泌物检测的实用性还需要更多的数据来验证。

 

图:阴道炎联合检测卡中的氧化酶


从总体上来讲,干化学酶检测操作方便,结果客观且成本较低,不失为一种适合于阴道分泌物的检测方法,然而受限于阴道菌群复杂的机制,其特异性总是那么不太乐观,所以多数沦为了形态学的陪衬。但是从微生物的角度来讲,形态学加干化学酶的组合又真的具有了更为深刻的意义。所以有时候,与其等待那可望不可及的天造与地设,不如多看一眼那一直陪着我们的相濡以沫,在岁月的见证里,也有一种归宿,叫情投意合。

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